Что такое посев на туберкулез

«Бактериологические исследования на туберкулез»

Бактериологические исследования на туберкулез
Бактериологический метод исследования патологического материала на микобактерии туберкулеза является более чувствительным, чем бактериоскопический. Надо, однако, иметь в виду, что в некоторых случаях под влиянием химиотерапии микобактерии туберкулеза могут не дать роста на питательных средах, в то время как при бактериоскопии они выявляются.
При бактериоскопии мазков из мокроты, окрашенных по Цилю — Нильсену, микобактерии могут быть найдены в тех случаях, если они содержатся в количестве около 500000 в I мл материала. Посев может дать положительный результат, если туберкулезные палочки содержатся в количестве нескольких десятков в I мл.
Для посева на микобактерии туберкулеза может быть использован любой материал, получаемый от больного (мокрота, моча, экссудаты, ликвор, промывные воды желудка, бронхов, мазки из гортани и т. д.), а также операционный и секционный материал. В большинстве случаев исследуемый материал, кроме туберкулезных микобактерий, содержит разнообразную постороннюю флору, которая на питательных средах растет гораздо быстрее туберкулезных микобактерий и препятствует росту микобактерий. Поэтому перед посевом материал подлежит специальной обработке.
Чаще всего в лаборатории приходится иметь дело с мокротой. При отсутствии у больного мокроты обычно исследуют промывные воды желудка В последнее время считается, что промывные воды бронхов дают больший процент положительных посевов, чем мокрота. Результаты посева мазков из гортани на тампоне, по литературным данным, уступают по количеству положительных ответов посеву мокроты, но он прост по технике взятия материала.
ОБРАБОТКА И ПОСЕВ МОКРОТЫ. Для посева мокроту собирают в стерильную баночку или плевательницу. Перед посевом больной должен прополоскать рот и зев кипяченой водой. Для исследования лучше брать первую утреннюю порцию мокроты до утреннего приема лекарств. Для освобождения мокроты от вторичной флоры при посеве применяют обработку серной кислотой по методу Гона или Мазура. Оригинальные методы, предложенные в свое время этими авторами, в последнее время были значительно видоизменены. Изменение методов обработки материала в основном сводится к снижению концентрации кислоты, применяемой для обработки, т. е. к выбору более щадящих методов микобактерий туберкулеза. Это связано со значительным изменением свойств микобактерий в результате интенсивной химиотерапии.
Метод Гона. После того как из мокроты обычным способом был приготовлен мазок, мокроту переливают в толстостенную банку с бусами или битым стеклом и гомогенизируют. Гомогенизацию производят энергичным встряхиванием банки в руках или в шютель-аппарате. Гомогенизированную мокроту заливают равным количеством 3—5% серной кислоты и тщательно встряхивают до полного смешивания мокроты с кислотой. Затем, когда мокрота превращается в гомогенную массу, ее переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют Обработка мокроты кислотой должна продолжаться 20 минут, из них 10 минут занимает центрифугирование. После окончания центрифугирования надосадочную жидкость сливают в дезинфекционный раствор и осадок засевают на 3—4 пробирки с яичной средой (Гельберга, Петраньяни или Левенштейна — Иенсена). Засев производят петлей (из толстой платиновой проволоки с несколькими оборотами) или пастеровской пипеткой.
Метод Мазура позволяет обходиться без центрифугирования. Гнойные комочки мокроты вносят в широкую пробирку, содержащую 3 мл 2% серной кислоты и энергично встряхивают в течение 3 минут. Туберкулезные микобактерии захватываются образующейся пеной, которую и засевают платиновой петлей. В последние годы для обработки мокроты пользуются комбинацией обоих методов, предложенной Гельбергом. Метод заключается в том, что после посева пены материал центрифугируется и засевается осадок.
Кроме серной кислоты, для освобождения мокроты от вторичной флоры пользуются 2—5% раствором едкого натра с последующей нейтрализацией 4—5% раствором соляной кислоты. Обработка происходит при температуре термостата в течение 30 минут— 1 часа. Для обработки материала с успехом пользуются 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия. Этот раствор хорошо гомогенизирует мокроту и освобождает ее от присутствия вторичной флоры. Хорошо гомогенизированную мокроту заливают двойным количеством этого раствора, хорошо смешивают и оставляют на сутки при температуре термостата. На следующий день весь материал центрифугируют и осадок засевают пипеткой на яичные среды.
ПОСЕВ ЛИКВОРА, МОЧИ, ЭКССУДАТА, ПРОМЫВНЫХ ВОД ЖЕЛУДКА И БРОНХОВ. Всякий жидкий материал, поступающий в лабораторию для посева, сначала необходимо центрифугировать. Если материал не содержит вторичной флоры (ликвор, серозный экссудат), то осадок или нижний слой жидкости в случае отсутствия осадка засевают без обработки на яичные среды. При посеве гнойного экссудата, мочи, промывных вод желудка или бронхов осадок после центрифугирования обрабатывают 3% серной кислотой в течение 20 минут, включая повторное центрифугирование, и после удаления надосадочной жидкости засевают на яичные среды.
Промывные воды желудка необходимо сеять как можно быстрее после их получения, так как жизнеспособность микобактерий в промывных водах под влиянием желудочного сока со временем снижается. Для исследования в лабораторию доставляется все полученное количество промывной жидкости.
ПОСЕВ МАЗКА ИЗ ГОРТАНИ. Микобактерии туберкулеза можно обнаружить в слизи из гортани. Больному предлагают покашлять и под контролем гортанного зеркала ватным тампоном снимают слизь с надгортанника. Тампон, снятый с зонда, помещают в ступку с 3—5% серной кислотой, тщательно отжимают, тампон удаляют, жидкость центрифугируют и осадок засевают на яичные среды. Обработку можно производить и следующим образом тампон осторожно опускают в пробирку с серной кислотой на 20 минут, также осторожно переносят его из пробирки с кислотой в пробирку со стерильным физиологическим раствором на несколько минут, а затем делают посев, втирая тампон в поверхность твердой среды.
Таким же образом делают посев всякого материала, взятого на тампоне; гноя, мазков из ран и т. д.
ПОСЕВ КРОВИ. Кровь берут из вены около 5 мл в пробирку со стерильным раствором лимоннокислого натрия. После центрифугирования осадок гемолизируют стерильной дистиллированной водой, центрифугируют, осадок обрабатывают 3% серной кислотой и после повторного центрифугирования засевают на питательные среды.
УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ПОСЕВОВ. Туберкулезные микобактерии на питательных средах растут довольно медленно, значительно медленнее, чем другие патогенные микроорганизмы. Предложены ускоренные методы посевов. Однако надо иметь в виду, что, несмотря на рост в более короткие сроки, эти методы дают все же значительно меньший процент положительных результатов. Поэтому при применении ускоренных методов рекомендуется делать параллельно посев на плотные яичные среды и в случае отсутствия роста при посеве ускоренным методом ждать результатов посева на яичных средах.
Метод Прайса. Из гнойных комочков мокроты делают мазки на стерильных предметных стеклах. Мазки подсушивают, обрабатывают 5% серной кислотой путем погружения мазков в кислоту на 5 минут, затем дважды промывают в стерильной дистиллированной воде и погружают в пробирки с кровяной средой (1 часть крови+3 части воды). Через 7—10 дней стекла извлекают из пробирок, отмывают от крови, сушат, фиксируют и после окраски по Цилю — Нильсену микроскопируют. При микроскопировании в случае роста видны типичные микроколонии палочек в виде «кос» и «жгутов».
Метод Школьниковой — метод глубинного посева на кровяную среду. Материал обрабатывают как обычно. Перед посевом осадок дважды отмывают при центрифугировании стерильной дистиллированной водой. Через 10—20—30 дней делают мазки из отцентрифугированного и отмытого осадка. Этот метод более чувствителен и дает больше положительных результатов, чем метод Прайса. Количество положительных результатов повышается при высевах с кровяной среды на яичную.
Туберкулезные микобактерии растут медленно, поэтому пробирки нужно выдерживать в термостате (при температуре 37—38°) в течение 2—3 месяцев, если рост не появляется раньше, и только после этого срока может быть дан отрицательный ответ. При появлении роста делают мазки из выросшей культуры, окрашивают по Цилю — Нильсену и микроскопируют. Если культура вырастает в обычные сроки, имеет типичные культуральные и морфологические признаки, то дается положительный ответ. При появлении роста в более ранние сроки в случае обнаружения каких-либо особенностей в культуральных и морфологических свойствах (пигментированная культура, нетипичный рост) культура подлежит дальнейшему изучению.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА.
При отрицательных результатах бактериоскопии и посева материала, исследуемого на микобактерии туберкулеза, если все же подозревается туберкулез, прибегают к опытам на животных (биологическая проба) как наиболее чувствительному методу выявления возбудителя туберкулеза. Диагностическим лабораторным животным является морская свинка. Этот метод дает возможность определить в патологическом материале жизнеспособных и вирулентных микобактерий. Надо учесть, однако, что микобактерии туберкулеза, устойчивые к препаратам гидразидов изоникотиновой кислоты (фтивазид и др.), вследствие снижения или потери вирулентности могут не вызвать туберкулеза у свинки.
Патологический материал для заражения животных собирают и обрабатывают так же, как и для посева, но здесь, кроме того, требуется тщательное отмывание осадка от следов серной кислоты (дважды физиологическим раствором с последующим центрифугированием), чтобы нейтрализовать вредное действие кислоты на животное. После нового добавления к осадку физиологического раствора полученную эмульсию вводят в количестве 0,5—2 мл морской свинке подкожно в правую паховую область. Зараженных животных помещают в отдельные клетки (при заражении одним и тем же материалом двух и больше животных их можно поместить в общую клетку, если позволяют размеры последней) и подвергают их систематическому наблюдению, обращая внимание на вес, изменения на месте введения материала и регионарных лимфатических узлов, а также общее состояние животного. Если животное не погибает от патологического процесса, то его забивают через 3—5 месяцев. Секционный материал от животного подвергают тщательному патологоанатомическому исследованию на туберкулез, если нужно, гистологическому и бактериологическому. Для ускорения диагностики туберкулеза у подкожно зараженной морской свинки можно, не ожидая гибели или забоя животного, произвести бактериоскопию на микобактерии туберкулеза содержимого регионарных к месту заражения лимфатических узлов или инфильтратов на месте инъекции.

Автор: Сейтимова Молдир

Областной противотуберкулезный диспансер

Источник

Бактериологические методы

В соответствии с современными программами ВОЗ, основой выявления туберкулёза за рубежом считают проведение микроскопии мазков мокроты, полученной от кашляющих больных, обратившихся к врачам общей практики; мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Эта методика входит в отечественный поликлинический и клинический минимум обследования пациента, выделяющего мокроту. В 1995 г. Минздравмедпром России в приказе № 8 «О развитии и совершенствовании деятельности лабораторной клинической микробиологии (бактериологии) лечебно-профилактических учреждений» подтвердил эту обязанность клинико-диагностических лабораторий. Обязательное бактериологическое исследование мокроты на М. tuberculosis должно быть организовано для нетранспортабельных больных, больных хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящей системы, а также для работников неблагополучных по туберкулёзу животноводческих хозяйств. Этот старейший метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения.

Микобактерии туберкулёза имеют вид тонких, слегка изогнутых палочек различной длины с утолщениями на концах или посередине, располагаются группами и поодиночке (рисунок 1,а) Окрашенные по Цилю-Нильсену мазки микроскопируют с иммерсионной системой не менее 10 мин.

Люминесцентная микроскопия

Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками (рисунок 1, б). Метод имеет неоспоримые преимущества, так как позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть фактически весь мазок, так же этот метод экономически более эффективен, так как уменьшается время, затрачиваемое на просмотр мазков.

К недостаткам метода ЛМ следует отнести значительно более высокую стоимость люминесцентного микроскопа, при процедуре окрашивания- соблюдение и коррекция pH мазка, а также освобождение микобактерий в диагностическом материале (особенно в мокроте) от окружающей их слизи, которая препятствует проникновению флуоресцентного красителя в микробную клетку. Поэтому нецелесообразно использование ЛМ для нативной мокроты, но применять этот метод рекомендуется при исследовании мазков, приготовленных после центрифугирования из осадка материала, обработанного для культурального исследования и нейтрализованного после деконтаминации. Поэтому метод ЛМ следует применять в бактериологических лабораториях, где культуральное и микроскопическое исследование может быть произведено из одной и той же порции диагностического материала.

Другим признаком туберкулёза является присутствие в препарате так называемых эпителиоидных клеток, из которых и развиваются клетки Лангханса. Это происходит при увеличении количества ядер без разделения цитоплазмы, которая только увеличивается в размерах (рисунок 1, г).

Микроскопия позволяет быстро получить результат, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью, невозможностью дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Рисунок 1

Культуральный метод

Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это «золотой стандарт» бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.

Следует отметить, что в связи с высокой избирательностью различных штаммов микобактерий и потребностью в полноценных белках до сих пор нет универсальной питательной среды, способной заменить все остальные. В Приказе № 109МЗ РФ для посева диагностического материала на МБТ рекомендуется использовать по одной пробирке международной питательной среды Левенштейна-Йенсена и Финна-2. Однако практика показывает, что кроме указанных сред целесообразно использовать и какую-либо из дополнительных, а посев на три пробирки питательной среды также повышает эффективность культуральной диагностики.

Для полноценной культуральной диагностики туберкулеза необходимо иметь соответствующие помещения и оборудование. Особенно важно наличие центрифуги и антиаэрозольной защитой и способностью обеспечить ускорение 3000g. А также шкафов биологической безопасности для предотвращения внутрилабораторного инфицирования.

Системы BACTEC

Из перечисленных автоматизированных систем наиболее эффективна в настоящее время система BACTEC MGIT 960BD. Флаконы MGIT с жидкой питательной средой 7Н9 содержат в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор, «погашенный» высокими концентрациями кислорода. При наличии роста микобактерий в процессе поглощения кислорода индикатор начинает светиться, регистрация флуоресценции в сисиеме BACTEC MGIT производится автоматически. Использование флаконов MGIT возможно и «вручную», тогда регистрацию свечения производят с помощью трансиллюминатора на флаконах MGIT составляет 11 суток.

Так называемые дефектные по клеточной стенке L-формы микобактерий и других инфекционных патогенов являются результатом изменчивости и основным видом персистирования, то есть переживания в неблагоприятных условиях. Посев на L-формы особенно эффективен при внелегочном туберкулезе, поскольку вегетация МБТ в очагах ВЛТ при повышенном ацидозе и анаэробиозе приводит к снижению их жизнеспособности и ферментативной активности.

Диагноз не может быть поставлен только на основании выявления L-форм микобактерий, но их обнаружение, особенно при верификации методом ПЦР, является весомым аргументом в пользу туберкулезной природы заболевания. В очагах внелегочного туберкулеза наблюдается ранняя L-трансформация микобактерий, поэтому их обнаружение позволяет поставить диагноз на начальных стадиях заболевания.

Источник

Посев на туберкулез (Mycobacterium tuberculosis) в Москве

Посев мокроты или мочи проводится для выявления микобактерий туберкулеза путем оценки роста культуры на дифференциально-диагностической среде. Наличие колоний микобактерий характерного цвета «слоновой кости» говорит об инфицировании биоматериала, сданного на исследование.

Анализ проводится в Москве и регионах, вся информация — по телефону единой справочной службы. Сдавать его можно не только в лаборатории: доступно взятие материала на дому (уточняйте у администратора клиники). Стерильная емкость приобретается заранее.

Приём и исследование биоматериала

Когда нужно сдавать анализ Посев на туберкулез (Mycobacterium tuberculosis)?

Подробное описание исследования

Посев на туберкулез относится к бактериологическим методам исследования. Данный вид диагностики дает возможность наиболее точно подтвердить наличие заболевания.

Микобактерии туберкулеза (mycobacterium tuberculosis) представляют собой прямые или изогнутые палочки, не имеющие жгутиков (неподвижные) и не образующие спор. Достаточно устойчивы к воздействию внешних факторов: в воде сохраняются до полугода, при обработке дезинфектантами жизнеспособны несколько часов. Тем не менее чувствительны к ультрафиолету и высоким температурам.

После поглощения особыми иммунными клетками, макрофагами, могут бессимптомно персистировать внутри них на протяжении нескольких лет. Способны к образованию L-форм — бактерий, у которых полностью или частично отсутствует клеточная мембрана. Благодаря такой особенности они не провоцируют выраженный иммунный ответ, длительно сохраняясь в организме и вызывая повторное инфицирование после завершения лечения.

Заболевание, которое вызывают mycobacterium tuberculosis, — одна из наиболее распространенных инфекционных болезней в мире. Всего в настоящее время в мире инфицировано — без клинических признаков заболевания — примерно 25-30 % населения. Путь передачи — воздушно-капельный, иногда контактно-бытовой, при использовании общих предметов обихода.

Туберкулез поражает в первую очередь легкие, хотя может затрагивать и прочие внутренние органы: кости и суставы, кишечник, почки, структуры центральной нервной системы, кожу. На долю легочной формы приходится примерно 80-90 % от всех случаев заражения. Проявления внелегочного туберкулеза разнообразны и зависят от локализации патологического процесса.

Симптомы при туберкулезе неспецифические, заболевание может быть заподозрено при наличии следующих симптомов:

Неспособность микобактерий выделять токсины обусловливает «мягкое» начало заболевания. Оно, как правило, не имеет острого дебюта, длительное время развивается бессимптомно, достаточно часто является «случайной диагностической находкой».

Важным механизмом защиты от инфекций является иммунный ответ организма. При туберкулезе легких он проявляется развитием воспаления с формированием специфической гранулемы. Это позволяет ограничить распространение инфекции.

Важным при диагностике туберкулеза является проведение посева мочи. Внелегочные формы заболевания могут поражать мочеполовую систему и долго протекать бессимптомно или с признаками воспалительного процесса, мочекаменной болезни.

Бактериологическое исследование — соскоб или мазок с последующим посевом на питательной среде — является «золотым стандартом» для диагностики туберкулеза. Наличие бактерий в организме подтверждается ростом колоний на питательной среде и является важным маркером заболевания у лиц из групп риска.

Источник

Пресс-центр

Вопрос-ответ: лабораторная диагностика туберкулеза

В Чувашской Республике проходит акция «Белая ромашка», посвященная Всемирному дню борьбы с туберкулезом, которая продлится до 20 апреля. О существовании этого недуга люди знали с древнейших времен. И в настоящее время туберкулез продолжает оставаться ведущей инфекционной болезнью, уносящей жизни людей во всем мире. Для

В распознавании и дифференциальной диагностике туберкулеза, а также в эффективности проводимого лечения очень важную роль играют лабораторные методы исследования. На наиболее распространенные вопросы о лабораторной диагностике туберкулеза отвечает заведующий бактериологической лабораторией Ольга Стебловская.

— Ольга Евгеньевна, расскажите, что такое МБТ?

— Где же находят эти туберкулёзные палочки?

Второе место по эффективности выделения МБТ у больных, не выделяющих мокроту, занимаю т исследования промывных вод бронхов.

— Как обнаруживают туберкулёзные палочки в лаборатории?

Частота обнаруж ения МБТ зависит от способа исследования биоматериала :

При бактериологическом способе исследования удается не только выявить туберкулезные палочки, но и подсчитать их количество, а также изучить лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам и составить схему лечения боль ного.

Бактериологический метод ( посев материала на специальные среды) обнаружения МБТ очень высокоточный, но имеет существенный недостаток: для получения культуры требуется 4-12 недель.

Применение жидких питательных сред и специального оборудования (бактериологических анализаторов) позволяет определить рост МБТ уже через 5дней.

В бактериологической лаборатории Республиканского противотуберкулезного диспансера представлен полный спектр методов для диагностики туберкулеза:

— бактериоскопические методы; кл ассический посев и определение л екарственной чувствительности МБТ на плотных средах;

— ускоренная методика на жидких средах с применением бактериологического анализатора BACTEC MGIT 960 ;

Источник

Туберкулез и микобактериоз. Общая информация

Туберкулез у человека вызывают микобактерии туберкулеза (МБТ): M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum, M.microti, M.canettii, M.caprae, M.pinnipedii, M. mungi, объединяемые в группу микобактерий, называемую Mycobacterium tuberculosis complex, к которой также относится вакцинный штамм M.bovis BCG. Преобладающим этиологическим агентом является M.tuberculosis. Кроме абсолютно-патогенных для человека микобактерий, к которым кроме МБТ относится микобактерия лепры, существуют еще нетуберкулезные микобактерии (НТМБ), около 30 видов которых являются условно-патогенными для человека, прочие являются сапрофитами. Все НТМБ являются убиквитарными – т. е. повсеместно распространенными в окружающей среде.

Микобактерии (МБ) отличаются высокой устойчивостью к воздействию физикохимических факторов. До полугода они могут сохраняться на объектах окружающей среды, в пыли, на страницах книг, в почве и воде, причем высушивание увеличивает их жизнеспособность. В высушенной мокроте МБТ сохраняют жизнеспособность в течение 10–12 месяцев и погибают при нагревании до 100. С только через 45 мин, а при 70. С – через 7 часов. Низкие температуры также способствуют сохранению жизнеспособных МБ – в масле и сыре при низких температурах они живут до 1 года.

Туберкулез (ТБ) – антропозоонозное инфекционное гранулематозное заболевание. Передается в большинстве случаев аэрогенным (воздушно-капельным или воздушно-пылевым), но встречаются также алиментарный, контактный и трансплацентарный пути заражения. Следует помнить о возможности перекрестного заражения ТБ человека и животных. Микобактериоз – заболевание, вызванное другими представителями рода Mycobacterium – НТМБ, которые могут передаваться от человека к человеку, но основным источником инфицирования служат сельскохозяйственные животные.

Оба заболевания характеризуются политропностью, т. е. в организме человека и животных при развитии патологического процесса могут поражаться различные органы. Более чем в 80% случаев развивается легочная форма заболеваний, в остальных случаях – внелегочная или сочетанные формы. Внелегочный ТБ, как правило, развивается вторично, в результате распространения туберкулезной инфекции из первичного очага, локализующегося обычно в органах дыхания. При этом первичный ТБ может быть отсроченным по времени с эпизодом проявления внелегочного ТБ и разрешиться ранее, либо вследствие проведения противотуберкулезной терапии, либо самостоятельно, без ее применения.

Заболеваемость туберкулезом в Российской Федерации в настоящее время высокая: 82,4–84,0 на 100 тыс. населения. Растет и число больных с резистентными к стандартной терапии штаммами МБТ. Особую угрозу туберкулез представляет для больных с иммунодефицитными состояниями, при которых он может протекать атипично, создавая трудности для клинико-лабораторной диагностики.

Среди контингента больных ВИЧ-инфекцией в РФ постоянно увеличивается число больных с поздними стадиями ВИЧ-инфекции. Это приводит к тому, что у все большего числа больных ВИЧ-инфекцией россиян, инфицированных МБТ, на фоне иммунодефицита развивается туберкулез. При этом туберкулез – главная причина смерти умерших от причин, связанных с ВИЧ-инфекцией (63,4% в 2010 г. по данным МЗ РФ). Европейское региональное бюро ВОЗ относит Россию к числу стран с наиболее неблагоприятной ситуацией по туберкулезу, сочетанному с ВИЧинфекцией.

Наиболее частыми этиологическими причинами микобактериозов у больных ВИЧ-инфекцией является Mycobacterium avium complex, M. xenopi, M. kansasii, M. fortuitum. Клинические формы этих поражений развиваются исключительно у лиц с выраженным иммунодефицитом. Диагностика легочного и внелегочного ТБ, а также микобактериоза, зависит от настороженности врачей, в первую очередь общей лечебной сети, а также доступности специальных методов исследования. Согласно приказу № 1224н от 29 декабря 2010 г. медицинские работники любых специальностей медицинских организаций РФ должны выявлять симптомы туберкулеза. При подозрении на туберкулез органов дыхания или внелегочной локализации в медицинских организациях проводится лабораторное исследование разных видов биологического материала, преимущественно – выявление возбудителя заболевания методом микроскопии.

Для защиты от ТБ применяется вакцинация, проведение которой регулируется федеральным законодательством. Вакцина представляет собой аттенуированный штамм M.bovis – M.bovis BCG. В ряде случаев вакцинация может вызывать осложнения, т.н. БЦЖ-иты.

ТБ в мире классифицируется в соответствии с МКБ-10, которая учитывает лишь метод подтверждения диагноза и локализацию процесса, и определяется кодами А15 – А19. В России существует собственная классификация, отражающая клинико- морфологические особенности патогенеза. В ее основу положены несколько принципов: клинико-рентгенологические особенности туберкулезного процесса (в т. ч. локализация и распространенность), его течение (т. е. фазы), а также наличие бактериовыделения. В приказе Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» сделана попытка совмещения обеих классификаций, когда к 4 знакам шифра МКБ-10 добавлено еще 6 знаков, в которых нашли отражение уточнения отечественной классификации.

Заболевания, вызванные НТМБ, а также другими представителями порядка Actinomycetales, имеющими близкое генетическое, иммунологическое, хемотаксономическое родство с МБ, микроорганизмами родов Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium и др., имеют сходную с ТБ локализацию патологического процесса, а также клиническую, в ряде случаев микробиологическую, и на определенных этапах патогенеза – морфологическую картины. Такие заболевания могут протекать под маской ТБ, что затрудняет его дифференциальную диагностику. Увеличивающееся в последнее время количество случаев заболеваний, вызванных подобными возбудителями, обусловлено увеличением количества иммунокомпрометированных лиц, а также развитием бактериологических и молекулярно-биологических методов исследования. Вопросы диагностики и лечения таких больных на законодательном уровне в РФ четко не обозначены.

Показания к обследованию

Дифференциальная диагностика. Первичная форма ТБ с поражением внутригрудных лимфатических узлов: саркоидоз I стадии, лимфогранулематоз, микобактериоз, лимфолейкоз, лимфосаркома, ретикулосаркома, центральный рак легкого, застойные изменения в легких на фоне сердечной недостаточности.

Диссеминированный ТБ: саркоидоз II стадии, бактериальная пневмония, профессиональные заболевания легких – пневмокониоз (силикоз и силикатоз, металлокониоз, карбокониоз, пневмокониоз, вызванные смешанной или органической пылью), микобактериоз, канцероматоз легких, фиброзирующий альвеолит, коллагенозы, гистиоцитоз Х, гемосидероз, криптококкоз, аспергиллез, гистоплазмоз, кокцидиоидоз, бластомикоз, гранулематоз Вегенера, хроническая интерстициальная пневмония, альвеолярный протеиноз, легочный васкулит.

Очаговый, инфильтративный ТБ и казеозная пневмония: внебольничная пневмония, периферический и центральный рак легкого, эозинофильный инфильтрат, актиномикоз легкого, нокардиоз, микобактериоз, ателектаз легкого, инфаркт легкого.

Кавернозный и фиброзно-кавернозный ТБ: абсцесс легкого, рак легкого с распадом, солитарные кисты легкого, бронхоэктазы, микобактериоз, нокардиоз.

Цирротический ТБ: саркоидоз III стадии и пневмофиброзы различной этиологии.

В случае округлых образований, наблюдаемых при рентгенологическом исследовании: периферический и метастатический рак, доброкачественные опухоли, эхинококкоз, аспергиллома, ретенционные кисты легкого, ограниченный осумкованный плеврит и артериовенозная аневризма легкого.

ТБ периферических лимфоузлов: саркоидоз, токсоплазмоз, микобактериоз, бруцеллез, болезнь Кикучи (гистиоцитарный некротизирующий лимфаденит), доброкачественный лимфоретикулез, лимфогранулематоз, неходжкинская лимфома.

У больных ВИЧ-инфекцией: вторичные заболевания, протекающие с поражением легких, генерализованные вторичные инфекции, онкологические поражения.

Материал для исследования

Мокрота, трахеальный смыв, материалы, полученные при проведении бронхоскопии – промывные воды бронхов, бронхоальвеолярный лаваж, а также материалы катетер- или щеточной биопсии, промывные воды желудка, экссудаты и транссудаты, гной, отделяемое ран, аспираты и пунктаты, спинномозговая и асцитическая жидкости, цельная кровь, моча, кал, секрет простаты, эякулят, менструальная кровь, ткани, в т.ч. фиксированные или в парафиновых блоках, смывы с предметов окружающей среды, а также культуры микроорганизмов, полученные при посеве этих видов материала для идентификации вида МБ.

Лабораторная диагностика туберкулеза и микобактериоза включает визуализацию кислото- и спиртоустойчивых бактерий при использовании микроскопии, получение первичной культуры или обнаружение ДНК/РНК МБ, их дальнейшее видовое дифференцирование и определение чувствительности возбудителя заболевания к противотуберкулезным препаратам культуральным методом или МАНК.

Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики и особенности интерпретации их результатов. По международным стандартам диагноз ТБ должен быть подтвержден бактериологически или гистологически.

Первоначальное исследование – микроскопия препарата мокроты или других жидкостей и тканей организма, взятых максимально близко к предполагаемой локализации патологического процесса. Микроскопия препарата с окраской по Цилю-Нильсену – быстрый, дешевый, но низко чувствительный метод (с его помощью можно обнаружить 105–106 микробных тел/мл), обладающий невысокой специфичностью, выявляющий все кислото- и спиртоустойчивые микроорганизмы. Метод не позволяет дифференцировать МБТ от НТМБ и, в ряде случаев, от других микроорганизмов порядка Actinomycetales. Диагностическая чувствительность метода составляет 20–65%.

Люминесцентная микроскопия препарата с окраской флуорохромными красителями – более чувствительный метод, т. к. позволяет проводить исследование при меньших увеличениях микроскопа и, следовательно, просматривать значительно больше полей зрения, чем при обычной микроскопии с иммерсионной системой при окраске по Цилю-Нильсену, что позволяет увеличить процент положительных находок на 10–17%.

Бактериологический посев на плотные питательные среды обладает большей чувствительностью и выявляет 100–1000 микробных тел/мл. Согласно стандартам микробиологической диагностики, обязательный посев проводится на 2 питательные среды, одной из которых является яичная среда Левенштейна-Йенсена (по рекомендации ВОЗ). В результате медленного роста, когда каждое деление микобактерий, в зависимости от вида, происходит через 2–24 ч, для получения результата требуется от 7 дней для быстрорастущих и до 2–12 недель для медленнорастущих, в число которых входит и МБТ.

Посев на жидкие питательные среды с помощью автоматических анализаторов BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD) и VersaTREK Myco (Trek Diagnostic Systems, Westlake, OH), позволяет получить результат через 4–42 дня.

В 2010 году в документах CDC, МАНК, наряду с культуральным методом, предложено использовать для подтверждения диагноза туберкулеза. В то же время, использование методов микроскопии ограничивается и предлагается для применения только в случаях невозможности проведения посева, при получении ложноотрицательного результата посева или его контаминации (пророста). Модификация программного обеспечения «Vercrit», используемого в противотуберкулезной службе США, выстраивает следующую иерархию доказательной диагностики ТБ:

Трехкратное взятие и исследование образцов биологического материала у пациента, например мокроты, увеличивает возможность обнаружения МБТ на 2–5%. Поэтому в отечественных и зарубежных руководствах по диагностике ТБ указана необходимость трехкратного, или, по меньшей мере, двукратного исследования образцов мокроты. Сбор первого образца мокроты проводится в присутствии среднего медицинского персонала для объяснения правильной последовательности действий пациента. Второй образец больной собирает вечером того же дня, а третий утром, после чего приносит их в лабораторию. В случае госпитализации больного образцы собираются последовательно в течение 3-х дней.

Вместе с тем, обнаружение МБТ в экскретируемых организмом жидкостях не всегда возможно даже при многократном сборе и исследовании материала методом ПЦР, что связано с преимущественно тканевой локализацией возбудителя ТБ. Поэтому в сложных диагностических случаях больным показано проведение гистологической диагностики ТБ. Образец ткани из очага патологического процесса, после проведения гистологической проводки и заключения его в парафин, можно исследовать как для верификации специфического туберкулезного воспаления, так и для подтверждения этиологической причины патологического процесса. Исследования проводят с помощью окраски бактерий по Цилю-Нильсену, иммуногистохимического исследования, позволяющего отнести обнаруженные микроорганизмы к роду Mycobacterium, а также МАНК, определяющих их видовую принадлежность.

С целью дифференцирования МБ до вида, необходимого для правильного определения этиологии заболевания, анализируют морфологические характеристики выросшей культуры, проводят ее микроскопическое исследование с окраской препаратов по Цилю-Нильсену, после чего осуществляют биохимические тесты и пересев на селективные питательные среды. Такая стратегия требует много времени как для получения достаточного для анализа роста культуры, так и для осуществления используемых методик. Однако даже применение всех методов позволяет дифференцировать МБ с точностью, не превышающей 95%, что связано с индивидуальными особенностями штаммов.

Дифференцирование до вида целесообразнее осуществлять с помощью молекулярно- биологических методов: ПЦР; гибридизация с ДНК-зондами, выявляющая наиболее распространенные МБ; высокоэффективная жидкостная хроматография, сравнивающая профиль жирных кислот клеточной стенки анализируемого микроорганизма с имеющимися в базе данных; секвенирование 16S rDNA и ITS-региона МБ, результаты которого анализируются с помощью интернет-ресурса RIDOM ( http://rdna.ridom.de ). Для дифференцирования некоторых НТМБ, особенно быстрорастущих (M.fortuitum, M.abscessus, M.chelonae), обязательно ориентируются на данные антибиотикочувствительности и результаты секвенирования. Практически для всех технологий, за исключением ПЦР, в качестве материала для исследования применимы только первичные культуры МБ, выросших на плотных или жидких питательных средах

Не менее важно дифференцирование до вида внутри группы Mycobacterium tuberculosis complex. Это связано с необходимостью определения источника заболевания, определения дальнейшей тактики противотуберкулезной терапии (при индикации М.bovis или ее вакцинного штамма М.bovis BCG, которые отличаются природной резистентностью к одному из основных ПТП – пиразинамиду, этот препарат не назначается), а также для подтверждения поствакцинальных осложнений у пациента. МР № 99/219 «Диагностика поствакцинальных осложнений после введения вакцины БЦЖ» предлагают с этой целью использовать диагностический комплекс, предусматривающий последовательное применение двух методов: культурального и ИФА для обнаружения АГ полученной культуры с помощью моноклональных АТ, специфически взаимодействующих с поверхностными АГ М.bovis, но не связывающимися с АГ М.tuberculosis. Исследование включает определение морфологических особенностей штамма, его тинкториальных свойств, спирто- и кислотоустойчивости, видовой принадлежности и изучение его лекарственной чувствительности к ПТП с обращением особого внимания на чувствительность к пиразинамиду. Несмотря на то, что в МР написано, что использование диагностического комплекса при морфологической верификации диагноза позволяет в 100% случаев верифицировать диагноз «БЦЖит», очевидно, что данные методы не позволяют дифференцировать М.bovis от ее вакцинного штамма М.bovis BCG. С этой задачей успешно справляется набор реагентов, основанный на использовании метода ПЦР, который выявляет виды M.tuberculosis complex: M.tuberculosis, M.bovis и ее вакцинный штамм M.bovis BCG и др. непосредственно в разных видах биологического материала.

Для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) МБ к противотуберкулезным препаратам с помощью культурального метода используют первичную культуру МБ. Существует 3 основных метода непрямого определения ЛЧ МБ: метод пропорций, метод коэффициента устойчивости и метод абсолютных концентраций на плотных и жидких средах. В России и большинстве стран мира наиболее распространенным и традиционно используемым методом определения ЛЧ МБ является непрямой метод абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна–Йенсена. Остальные методы определения ЛЧ МБТ являются альтернативными. Основным недостатком традиционных культуральных методов определения ЛЧ МБТ, является их чрезвычайная длительность. Результаты исследования ЛЧ первичной культуры МБ учитываются через 3–4 недели инкубации для плотных и 4-13 дней для жидких питательных сред, поэтому необходимая коррекция химиотерапии может быть проведена не ранее, чем через 10–60 дней или 40–120 дней, в зависимости от используемых питательных сред, от момента поступления в лабораторию диагностического материала.

Определение ЛЧ с помощью молекулярно-биологических методов основано на выявлении мутаций, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости к ПТП. Основное преимущество таких методов заключаются в скорости получения результатов анализа – 1–2 дня, что достигается вследствие возможности использования для тестирования непосредственно клинического материала, хотя возможно использование также и первичной культуры.

Необходимо учитывать, что наборы реагентов, основанные на применении разных методов, характеризуются разными показателями чувствительности и специфичности. Гибридизационные технологии, такие как ДНК-микрочипы, могут обнаруживать только конкретные мутации, внесенные в дизайн диагностических наборов и/или дикий тип МБТ. Их диагностическая чувствительность в значительной степени зависит от спектра генетических изменений штаммов МБТ, характерных для данного географического региона, в случае наличия других мутаций исследование будет давать ложноотрицательные результаты.

Метод секвенирования является «золотым стандартом» в молекулярной диагностике, он может определять любые изменения в нуклеотидной последовательности, в т. ч. протяженные инсерции и делеции. На сегодняшний день выпускаются наборы реагентов, а также специальное программное обеспечение, автоматизирующее процесс получения результатов.

Из вышеназванных исследований тестами лабораторной диагностики in vitro являются IGRA, в настоящее время представленные наборами QFT-IT и T-SPOT. TB. Исследование основано на стимуляции мононуклеарных клеток пациента антигенами, специфичными для M.tuberculosis complex, в ответ на которую высвобождается гамма-интерферон (IFN-.). АГ представлены секреторным белком 6-kDa early-secreted antigenic target (ESAT-6), его шапероном 10-kDa culture filtrate protein (CFP-10), а также дополнительным туберкулезным протеином TB 7.7 (p4) (только в наборе QFT-IT). Эти белки отсутствуют у всех вариантов вакцинного штамма M.bovis BCG и большинства НТМБ, за исключением M.kansasii, M.marinum, M.szulgai, M.flavescens и M.gastrii. Следовательно, оба теста всегда будут давать отрицательный результат при поствакцинальной аллергии или БЦЖ-ите, и ложноположительный результат при наличии в организме НТМБ: M.kansasii, M.marinum или M.szulgai, имеющих клиническое значение.

Тесты IGRA не могут дифференцировать у человека состояние инфицированности МБТ (латентный ТБ) и активный ТБ. Их результаты должны оцениваться совместно с клиническими и рентгенологическими данными, сведениями о контактах, микробиологическими исследованиями и т. д. Особое значение приобретает использование тестов IGRA в странах, где проводится вакцинация БЦЖ. В случае положительной пробы Манту и отрицательном результате теста IGRA у пациента достоверно подтверждается состояние поствакцинальной аллергии. При конверсии результатов теста IGRA, т. е. при изменении отрицательного результата на положительный, риск последующего развития активного туберкулезного процесса не увеличивается. У иммуносупрессивных пациентов IGRA-тесты, как и проба Манту, будут отрицательными, что не может исключить у них активного туберкулезного процесса.

Наиболее удобно применять тесты IGRA у пациентов, ранее вакцинированных против ТБ, у лиц, имеющих противопоказания к проведению кожного теста, у детей, а также у тех пациентов, которым сложно попасть на повторный прием к врачу через 72 часа для определения результатов пробы Манту. В зарубежной практике тесты IGRA используют вместо или вместе с пробой Манту, во многих странах такие исследования закреплены законодательно.

IGRA-тесты являются качественными, их результаты выдаются в категориях: положительный, отрицательный и неопределенный.

Положительный результат означает текущую инфекцию МБТ, но не позволяет дифференцировать недавнее инфицирование МБТ от ранее произошедшего, а также оценить степень активности туберкулезного процесса.

Отрицательный результат чаще означает отсутствие МБТ в организме человека, но может наблюдаться и при супрессии Т-клеточного звена иммунной системы, наступившей вследствие иммунодефицитного состояния, в т. ч. и при прогрессировании туберкулеза. В этом случае следует ориентироваться на результаты прямых методов исследования, подтверждающих специфическую природу заболевания.

В редких случаях результаты тестов не могут быть интерпретированы вследствие не прохождения положительного контроля теста и оцениваются как неопределенные. В этом случае нельзя ни подтвердить, ни исключить туберкулезную инфекцию.

Следует помнить, что у части больных не удается обнаружить МБТ традиционными микробиологическими методами и даже методом ПЦР (если не проводится биопсийный забора материала). В этих случаях диагноз ТБ будет основываться на клинических данных, результатах косвенных методов диагностики и терапии ex juvantibus, а принимаемые по этому поводу решения полностью зависят от квалификации и опыта врача-фтизиатра. Вследствие этого, учитывая биологические особенности микроорганизма, а также иммунного ответа организма человека, диагностика ТБ не может ограничиваться каким-либо одним методом и должна проводиться комплексно.

Показания к применению лабораторных исследований для диагностики туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией и особенности интерпретации их результатов. Основной принцип диагностики туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией такой же, как и у пациентов с ВИЧ-негативным статусом – выявление достоверных признаков специфического воспаления (детекция возбудителя либо морфологическая верификация).

Самым важным в диагностике туберкулеза у больных ВИЧ-инфекцией является выявление возбудителя. У этой категории больных частота выявления МБТ из мокроты уменьшается по мере снижения количества CD4+лимфоцитов (ввиду снижения регистрации деструктивных форм). Однако при глубоком иммунодефиците (менее 100 клеток/мкл), вероятность обнаружения МБТ повышается (за счет огромного количества возбудителя в легочной ткани). Важно отметить, что у больных полиорганным туберкулезом не менее ценным, чем исследование мокроты, является выявление возбудителя в другом диагностическом материале. Поэтому необходим обязательный поиск МБТ в любых биологических жидкостях и биопсийном материале. Также для детекции МБТ целесообразно применять молекулярно-биологические методы, чувствительность и специфичность которых значительно превосходит традиционные микробиологические методы.

Туберкулиновая чувствительность у больных с активным туберкулезом на фоне ВИЧ-инфекции снижается по мере прогрессирования иммунодефицита, и у пациентов с количеством CD4+лимфоцитов менее 100 клеток/мкл частота регистрации положительной пробы Манту с 2 ТЕ не превышает 10%, а при количестве CD4 клеток более 500/мкл она сопоставима с группой больных без ВИЧ-инфекции (до 95%). Проведенные клинические исследования показали, что при высокой специфичности Диаскинтеста (до 100%), чувствительность этого диагностического метода также снижается по мере уменьшения количества CD4+лимфоцитов и сопоставима с чувствительностью реакции Манту.

При неинформативности туберкулинодиагностики, Диаскин- и IGRA-тестов, снижении вероятности выявления МБТ в мокроте и расширении дифференциально- диагностического ряда за счет других вторичных заболеваний в диагностике специфического процесса важную роль приобретает малоинвазивная хирургия с целью морфологической верификации туберкулезного процесса. Морфология туберкулезного воспаления тесно связана с состоянием иммунной системы больного и в значительной степени зависит от него. Гистоморфологические проявления туберкулезного воспаления при ВИЧ-инфекции утрачивают свои специфические признаки по мере ее прогрессирования. У больных с количеством СD4+лимфоцитов более 350 клеток/мкл сохраняется способность к формированию типичной гранулематозной реакции. В биоптатах пациентов с более тяжелой степенью иммуносупрессии (число СD4+лимфоцитов 200–350 в мкл) преобладает несовершенная стертая гранулематозная реакция. Это свидетельствует о смене реакции гиперчувствительности замедленного типа, типичной для туберкулеза, реакцией гиперчувствительности немедленного типа. Состояние выраженного иммунодефицита (при количестве СD4+лимфоцитов менее 200 клеток/мкл), характеризуется в большинстве случаев некротическими изменениями с выраженным экссудативным компонентом воспаления. Однако при проведении микроскопии препаратов биопсии с окраской по Циль-Нильсену обнаруживаются кислотоустойчивые бактерии в большом количестве (20-50 и более в одном поле зрения). В связи с этим у больных ВИЧинфекцией, особенно на фоне выраженной иммуносупрессии, важно проведение комплексного поэтапного изучения биопсийного материала с проведением микроскопии препаратов с окраской по Цилю-Нильсену, микроскопических исследований с применением методов иммуногистохимии (использование моноклональных АТ к M. tuberculosis) и ПЦР для выявления ДНК МБТ в нативном материале и из парафиновых гистологических блоков. Обнаружение микобактерий в кале, мокроте или бронхоальвеолярном лаваже при отсутствии клинической симптоматики может свидетельствовать только о колонизации слизистых оболочек.

Источник