Микротомы
Под микроскопом целый орган не изучишь. Поэтому для микроскопических исследований готовят специальные препараты: делают очень тонкий срез ткани, подлежащей изучению. Готовятся такие срезы с помощь аппарата, именуемого микротом. На рынке современного оборудования для медицинских и биологических исследований сейчас есть из чего выбрать. Принцип стабилизации исходного растительного или животного материала в микротомах различных марок реализован по-разному. Чаще всего это быстрая заморозка или заливка в парафин. Различаются в зависимости от модели микротома и размеры полученных срезов.
Один из таких приборов — микротом замораживающий МЗ-2. С его помощью получают срезы замороженных животных или растительных тканей для микроскопического исследования. Уже из названия прибора ясно, какой принцип заложен в основу его работы. Быстрым охлаждением с помощью углекислоты подлежащая исследованию ткань замораживается, и с помощью охлажденного той же углекислотой специального ножа делается срез заданной толщины. Прибор оснащен специальным столиком с автоматической микроподачей на заданную величину. В комплект микротома входит два ножа размером 100х35мм, ручка и обушки, которые применяются при заточке и правке ножей. Диапазон автоматической подачи объекта от 1 до 30 мкм, наибольший размер среза 35х35 мм. Микротом МЗ-2 очень часто применяют для экспресс-анализа тканей.
Действие микротома ротационного МПС-2 основано на ином принципе. С его помощью получают серии срезов животных и растительных тканей, предварительно залитых в парафин. Он оборудован механизмом автоматической подачи транспортной ленты и двумя ножами. Автоматическая подача держателей ножей производится в диапазоне от 1 до 45 мкм, цена деления — 1 мкм. Микротом МПС-2 обеспечивает больший размер среза, чем МЗ-2 — 40х50 мм. Диапазон автоматического перемещения транспортной ленты за один оборот маховика от 1 до 25 мм. Как и практически в любой другой модели в комплекте микротома замораживающего МПС-2 имеется набор приспособлений для заточки и правки ножей.
Санный микротом МС-2 выполняет ту же функцию, что и уже описанные модели. Получение срезов из залитого в парафин или целлоидин исходного материала обеспечивается микрометрическим перемещением столика в вертикальной плоскости. Столик может перемещаться автоматически или вручную. Микротом укомплектован двумя ножами размером 250 мм, обушками, ручками, которые применяются при заточке и правке ножей. Подача исходного материала в ручную или автоматически производится в диапазоне от 1 до 30 мкм. Максимальный размер среза составляет 35х45 мм. Среди всех приведенных моделей МС-2 самый массивный. Его габаритные размеры 450х250х270 мм и приличная масса — 25 кг.
Микротом ротационный что это такое
В настоящее время среди методов клеточной биологии широко используются так называемые переживающие срезы нативной ткани («slаces», толщина слайсов – 200–400 мкм). Особенно много работ на слайсах проводится в различных исследованиях центральной нервной системы [1,9 и др.]. Однако метод переживающих срезов можно использовать в различных областях экспериментальной клеточной биологии: сочетание с электронной микроскопией, длительным культивированием эксплантатов ткани, в интравитальной микроскопии in vitro и др.
Невзирая на то, что ряд фирм выпускает коммерческие приборы для получения слайсов (резаки, вибратомы), продолжаются поиски новых технических решений приборов для микротомирования нативной ткани.
В данной статье рассматривается конструкция оригинального резака нативной ткани, на основе модификации стандартного ротационного микротома.
Описание конструкции микротома-резака
1. Базовая конструкция модифицированного ротационного микротома
В основе устройств использована стандартная схема ротационного микротома для получения гистологических срезов из фиксированной ткани (рис. 1).
Микротомный узел закреплен на общем основании (1). на вертикальной станине (2) каретка (3), совершает вертикальное поступательно-возвратное движение при помощи кривошипо-шатунного механизма (на схеме не показан). на каретке закреплена пластинка (4) с направляющими типа «ласточкин хвост». Вдоль пластинки (4) двигается призма (5). В стандартном ротационном микротоме на переднем конце призмы закреплен блок ткани, который двигается на определенное расстояние вперед и при движении каретки (3) вниз ткань режется ножом микротома, закрепленном на основании микротома (1). на другом конце призмы имеется гайка (7), в которой двигается специальный правозаходный микровинт (8). на заднем конце оси микровинта имеется шаровая опора (9) и храповое колесо (10). При движении храпового колеса по часовой стрелке, при каждом цикле вертикального движения каретки (3) микровинт продвигает вперед призму (5) на расстояние определяемое шагом микровинта и величиной поворота храпового колеса. Обычно толщина срезов, получаемых на ротационном микротоме, находится в диапазоне (0,5)1 – (15)20 мкм.
Рис. 1. Схема базовой конструкции резака. Объяснения в тексте
2. Модификация ротационного микротома для резки нативной ткани
а) Вместо ручного привода движения каретки (3) разработан специальный электропривод (на рис. 1 не показан), обеспечивающий работу кривошипо-шатунного механизма, приводящего в движение каретку (3). Дистанционное управление электроприводом (ножная педаль) освобождает руки экспериментатора для манипуляции со срезами нативной ткани.
б) Устанавливается микровинт (8) с левосторонней пятизаходной резьбой с шагом 5 мм. Храповое колесо с 200-ю зубцами позволяет осуществлять передвижение призмы назад от оператора на расстояние 25 мкм/на зуб колеса.
в) На основании микротома укрепляется кювета, в которой в специальный держатель в виде ванночки из желатины (агара) (рис. 2а) помещается нативная ткань.
Дно кюветы (1) имеет паз (2) глубиной 1 мм и шириной 15 мм. по бокам паза закреплены две пластинки (3) из нержавеющей стали толщиной 0.2 мм. Внутрь паза помещается желатиновый держатель ткани в виде ванночки (4). Держатель ткани помещается у передней стенки кюветы, а затем плавным движением вдвигается в паз. Желатиновая ванночка-держатель ткани прочно удерживается в пазе кюветы пластинками (3). В центральный канал желатиновой ванночки помещается образец ткани (5). Кювета (1) закрепляется на основании микротома-резака (6).
г) В переднюю часть призмы (5) вставляется держатель режущего инструмента (6 на рис. 1; рис. 2а, в). Держатель представляет рамку, в которой натянута половинка лезвия безопасной бритвы (режущий инструмент). Вид сверху (рис. 2в) показывает, что рамка держателя имеет хвостовик (14) для вставки в призму и винт (13), при помощи которой фиксируется угол положения рамки относительно образца нативной ткани.На рис. 2а показано крайнее нижнее положение режущего инструмента. Видно, что режущая кромка лезвия бритвы (7) не касается поверхности кюветы. В начале работы призма с держателем режущего инструмента перемещается в крайнее переднее положение ручкой храпового колеса. При резке режущий инструмент уходит назад от оператора, а срез ткани остается на передней стенке лезвия бритвы.
Для приготовления желатиновых ванночек используется специальное приспособление (рис.2б), состоящее из двух деталей: основания (8) и крышки (9). Крышка имеет выступы (10), размеры которых определяют ширину агаровых ванночек. Основание устройства имеет перегородки (11), определяющие размер канала в желатиновой ванночке (12). В пространство между основанием и крышкой заливается нагретый 6-8 % раствор желатины. После охлаждения желатины устройство разбирается, ванночки вынимаются и хранятся до использования в холодильнике в закрытой влажной камере (чашка Петри). В зависимости от размера образца ткани, определяется размер перегородок в основании описанного устройства. Например, для приготовления переживающих срезов хвостатого ядра мозга крысы (nuc. caudatus), мы использовали желатиновый ванночки с размером канала 4 х 4 мм.
Рис. 2. Схема кюветы, блока режущего инструмента и устройства для приготовления агаровых ванночек. Объяснение в тексте
Обсуждение. Для приготовления срезов нативной ткани в разное время было предложен ряд устройств для ручного и механизированного приготовления слайсов [2, 3, 6-8 и др.].
В описанной конструкции резака на основе модификации стандартного ротационного микротома удачно решено надежное закрепление образца нативной ткани относительно режущего инструмента. Применение агаровых ванночек, предложенное в данной работе, имеет явные преимущества перед описанными в литературе способами (закрепление образцов ткани на фильтровальной бумаге при помощи агара, желатины или полимерных (акриловых) клеев).
Описанный резак позволяет надежно готовить из нативной ткани слайсы толщиной 200-400 мкм. Известно, что именно этот диапазон толщин позволяет проводить изучение электрической активности нейронов в слайсах (in vitro).
Использование электропривода с дистанционным управлением позволяет быстро готовить небольшие серии слайсов из различных тканей.
Особенно удачно описанный резак был использован при получении слайсов из разных отделов головного мозга лабораторных животных для проведения электрофизиологических исследований (см., например, [4, 5, 10 и др.].
Работа поддержана грантом РФФИ, проект 14-00-295.
Приготовление гистологических срезов
Образцы тканей могут браться у человека сразу после смерти (чем быстрее, тем лучше) – аутопсия. Также материал может браться во время операции или непосредственно в диагностических целях при помощи специальных инструментов – биопсия.
Приготовление образцов
Приготовление образцов происходит в несколько этапов:
Суть фиксации материала заключается в остановке естественных процессов в тканях и клетках. Это необходимо для того, чтобы во время купировать процесс гниения и ферментативные изменения в структуре тканей.
В фиксируемых тканях за счет физико-химических процессов происходит свертывание (коагуляция) белков и липоидной составляющей. Это состояние позволяет тканям долго храниться в неизменном виде, без реакции на различные воздействия. Проще говоря, фиксация тканей проводится с целью сохранения прижизненной структуры биологического материала.
Для фиксации тканей применяются специальные жидкости (фиксаторы). Наиболее популярными фиксаторами можно назвать следующие варианты жидкостей:
Выше перечислены простые фиксаторы. Также для фиксации тканей применяются более сложные варианты фиксаторов (растворы):
В списках указаны лишь некоторые виды применяемых фиксаторов. Продолжительность необходимого для фиксации образцов тканей периода может варьироваться от нескольких часов до суток. Длительность зависит от особенностей исследуемых образцов и типа выбранного фиксатора. После того как этап фиксации пройден необходимо произвести промывку материала (в течение нескольких часов) в проточной воде. Это делается для того чтобы освободить образцы от излишков фиксирующей жидкости и осадочной взвеси.
Мутные непрозрачные образцы не подходят для исследования. Такие кусочки материала не позволят получить необходимую информацию. Перед тем как приступить к одному из главных этапов – осуществлению среза, образцы промываются чистой водой в течение нескольких часов. Далее, материал подвергается процессу обезвоживания. Обезвоживание осуществляется при помощи проведения тканевого образца через спирты возрастающей крепости. Этот этап длительный. В каждом спирте кусочки материала находятся от 2-3 часов до суток.
Подготовленные к изучению образцы исследуют при помощи специального микроскопа.
Прежде чем приступить к изучению гистологического препарата необходимо убедиться, что последний полностью соответствует ряду обязательных требований:
При качественном приготовлении препарата достичь соответствия всем перечисленным требованиям достаточно просто. Однако нельзя исключить возможность возникновения небольших погрешностей. Если вовремя распознать некоторые виды неточностей, купировать брак, создать качественный материал вполне возможно.
Самыми распространенными погрешностями при приготовлении срезов можно назвать следующие варианты:
Те или иные погрешности могут возникать по разным причинам. Иногда в основе нарушения качества образца лежат ошибки во время изготовления. Для устранения каждой погрешности предусмотрены определенные алгоритмы действий.
Методы гистологического исследования
Для осуществления микроскопического исследования необходимы тонкие кусочки материала. Ширина таких кусочков измеряется в микрометрах. Для удобства получения таких срезов используются специальные приборы – микротомы. Конструкция этого прибора предусматривает возможность получения срезов толщиной 5-10 микрометров.
Основным методом исследования в гистологии является микроскопия. При помощи микротома можно изготавливать тончайшие срезы, подходящие для проведения микроскопических исследований. Получение среза происходит за счет движения ножа в одном направлении. Толщина среза задается на этапе срабатывания механизма подъема.
Для изготовления срезов из материала, залитого парафином или целлоидином, используют радиальный, ротационный или санный микротом.
Для получения среза с растительных или животных тканей могут применяться специальные замораживающие микротомы. Для микроскопического исследования используется несколько методов приготовления срезов. Для каждого из методов выбираются определенные виды микротомов и применяются определенные четкие алгоритмы действий.
Гистологические срезы бывают:
Могут производиться срезы фиксированного и нефиксированного материала. Все зависит от характера исследуемых тканей и основных целей проведения означенного исследования. Также в гистологии существуют другие методы приготовления срезов.
Микротомы и их применение
Как уже было сказано выше, срезы в гистологии создаются при помощи специального устройства – микротома. В самом названии заложена расшифровка предназначения прибора – micros (маленький), tome (рассечение). Одним из самых используемых можно назвать санный микротом.
Название прибора произошло от принципа работы механизма, который базируется на подаче ножа с зажимом при помощи специальных салазок. Санный микротом предназначен для осуществления парафиновых срезов. Как правило, такой прибор работает с одноразовыми лезвиями или кассетами. Такой высокоточный микротом состоит из станины, механизма микроподачи, подъемного механизма, зажимов для блоков, ножедержателя.
Такой аппарат позволяет изготавливать срезы толщиной от 0,5 до 60 микрометров. Санный микротом отличается высокоточной регулировкой толщины среза. Функция подачи материала может быть механической или ручной. Данный прибор предназначен для осуществления рутинных исследований в области медицины, ботаники и биологии.
Для получения срезов с нефиксированных тканей или в тех случаях, когда необходимо срочное проведение исследования используются замораживающие микротомы. Такие приборы снабжены замораживающим столиком, на котором и закрепляется исследуемый образец. Главным правилом успешного получения гистологического среза при помощи микротома является правильный выбор угла наклона ножа и угла сечения. Наилучшим углом наклона является тот, при котором плоскость лезвия находится параллельно верхней части блока.
Если выбрать угол наклона больший, чем требуется, образуется риск, что срез будет крошиться. При меньшем угле наклона лезвие будет скользить по поверхности материала. Получение требуемого результата при таком положении ножа невозможно. Величина угла сечения зависит от характера исследуемого материала. Чем образец мягче, тем меньше будет угол резания. При обработке мягких блоков неплохим вариантом считается косое расположение ножа.
Резание на микротоме
Для приготовления срезов с парафинированных объектов или образцов, обработанных целлоидином, опять же чаще всего используют ротационный микротом.
Сначала блок подвергают обрезке. Это необходимо для устранения свободного парафина или другого уплотнителя. Если эту процедуру не произвести, срез может получиться неравномерным, морщинистым и, как следствие, малоинформативным. Также сморщивания можно избежать при помощи охлаждения исследуемого материала.
Далее, парафиновый блок прочно закрепляется в зажиме. Предварительно необходимо выверить правильный угол расположения ножа и выбрать необходимый угол резания. После этого нужно используя регулировку механизма подачи, установить блок так, чтобы его поверхность находилась от лезвия ножа на расстоянии 0,5-1 мм.
После осуществления подгонки проводится установка микрометрической шкалы для получения первых толстых срезов. После этого производится моделирование блока (срезка излишков парафина, предание прямоугольной формы). Заключительным этапом является выставление микрометрической шкалы на задуманную толщину и осуществление окончательной резки материала.
Микротомы
PFM Medical GmbH Slide 4003Е
PFM Medical GmbH Slide 2003
PFM Medical GmbH Rotary 3002
PFM Medical GmbH Rotary 3003
PFM Medical GmbH Rotary 3004 M
PFM Medical GmbH Rotary 3005 E
PFM Medical GmbH Rotary 3006 ЕМ
Medite MEDITOME M530
Классификация и назначение микротомов
Микротом — это автоматический прибор, предназначенный для изготовления серии образцов биологической ткани для гистологического исследования, чтобы в результате получить срез исходного материала одинаковой толщины от 10 нм до 12 мкм.
Существуют 3 основных типа конструкции микротомов, которые используют в зондовой, оптической и электронной микроскопии:
По толщине получаемого образца ткани микротомы делят на:
Стандартные микротомы позволяют получить срез толщиной в 1–12 микрон, а ультрамикротомы предназначены для изготовления срезов толщиной в 10 нанометров.
Конструкция каждого микротома состоит из 3 основных составляющих:
1. Станины (тяжелого корпуса).
2. Подвижного столика, фиксирующего объект.
3. Микротомного ножа с держателем.
В зависимости от механизма действия микротомы делятся на:
На микротоме в зависимости от технологии изготовления можно получить срезы следующей толщины:
Санный микротом
Ротационный микротом
Ротационный микротом предназначен для работы с исходным материалом, который предварительно был залит в парафин. Представляет собой конструкцию с неподвижным ножом и перемещающим объект столиком. Может изготовить срез толщиной в 1–2 мкм. Как правило, подача материала для изготовления образцов осуществляется автоматически.
Замораживающий (радиальный) микротом
Статьи
Применение современных ультразвуковых сканеров позволяет быстро и наиболее точно диагностировать огромное количество заболеваний, а также лечить целый ряд недугов.
Качество работы сканирующей ультразвуковой системы в большинстве случаев зависит от правильно подобранного УЗИ-датчика.
В настоящее время медицинское обследование с помощью ультразвука является одним из наиболее распространенных методов диагностики.
Многие переплачивают за новое оборудование для больниц и клиник, хотя восстановленная медтехника ничем не хуже.
Виды и применение микротомов
Микротом – это специальное устройство, при помощи которого происходит изготовление тонких гистологических срезов тканей биологических объектов и растений. Подготовленный материал может иметь толщину от долей микрон до нескольких микрон. Прибор состоит из микротомного ножа и столика, на котором закрепляется объект для произведения срезов.
Для чего нужны микротомы?
Микротомы подготавливают материал для проведения исследований или постановки диагноза при помощи классического оптического микроскопа. Именно от качества подготовки биологических тканей или срезов растений зависит результат работы или точность постановки диагноза.
Какие бывают микротомы?
Устройства отличаются своим строением, что влияет на область их использования и режим работы. Поэтому получить высокие результаты при изучении срезов возможно только при правильном выборе микротома. Выбрать подходящий прибор можно в каталоге https://alt.ua/products/mikrotomy.
Все существующие микротомы можно разделить на такие виды:
1. Ротационные
С его помощью получают тонкие и полутонкие срезы для лучшего исследования на цифровом микроскопе. Микротом изготавливает идеальные срезы для всех видов тканей. Это достигается благодаря использованию больших и тяжелых ножей, которые создают минимальные вибрации при резке. Также легко регулируется угол среза. Такие микротомы отлично режут залитые в парафин блоки ткани.
2. Качающиеся
Нарезка ткани происходит при помощи качающихся траверсов, при помощи которых происходит ее движение. Устройство простое и доступное по своей стоимости. Оно не требует особенного обслуживания. Однако при этом микротом имеет легкий вес, что делает весь прибор неустойчивым во время резки. Также есть ограничения по размеру блока срезов.
3. Санный
Прибор чаще всего используют для резки образцов в офтальмологии и невропатологии, т.к. может готовить срезы от 1 до 60 мкм. Микротом подготавливает к исследованию большие образцы тканей при помощи неподвижного ножа и скользящей каретки.
Прибор очень устойчив и может регулировать угол наклона ножа, но при этом все операции производятся довольно медленно.
4. Замораживающий
Микротом такого типа используется при резке замороженных блоков, но нужно учесть, что стабильные высококачественные срезы с его помощью получить трудно. Во время работы происходит перемещение ножа, а непосредственно образец для резки остается неподвижным.
5. Раздвижной
6. Вибрационный
Микротом применяется для тех образцов, которые предварительно не подготавливались к резке (не фиксировались и не замораживались). Подходит для работы в ультраструктурной гистохимии, а также гистохимии ферментов. Резка тканей происходит на низких скоростях, что помогает избежать дезинтеграции.
7. Компьютеризированный
Современное устройство, в которое входит быстродействующий термостатический переключатель, криопластина, а также возможность криоскальпирования. Такие микротомы могут делать срезы, толщиной 1-25 мкм.
8. Лазерный
Микротом может выполнять максимально точные срезы бесконтактным способом, которые не приводят к термическим повреждениям. Устройство используется даже на неподготовленной к резке ткани, что снижает количество времени во время работы.
Правильный выбор микротома – это залог успешного исследования среза ткани и получения точных результатов.