музейные штаммы микроорганизмов что это

Роспотребнадзор

Роспотребнадзор

О необходимости наличия в лаборатории музейных культур

О необходимости наличия в лаборатории музейных культур

В целях исполнения требований к организации работы в каждой лаборатории, проводящей бактериологические исследования с ПБА I-IVгрупп патогенности, необходимо наличие музейных культур (тест-культур), соответствующих характеру проведения исследований.

Музейные культуры могут иметь только лаборатории юридических лиц, у которых имеется лицензия на право работы с микроорганизмами I-IV- групп патогенности.

С помощью музейных культур осуществляется контроль биологических свойств питательных сред. Контроль питательных сред подразделяется на качественный и количественный.

Задачей качественного контроля является выявление грубых нарушений технологии приготовления питательных сред, приводящих к выраженному снижению ростовых и дифференцирующих свойств. Качественный контроль осуществляется после каждой варки питательной среды.

Количественный контроль позволяет выявлять относительные изменения ростовых свойств из-за ряда причин, возникающих на этапах транспортирования, хранения, приготовления, стерилизации, а также при изменении технологических требований производства питательных сред, в результате которых они оказываются менее эффективными.

Таким образом, для своевременного и непрерывного осуществления качественного контроля ростовых свойств питательных сред в бактериологической лаборатории необходимо наличие соответствующих музейных культур.

Для этих целей необходимо обеспечить выполнение требований санитарного законодательства в части организации работы с музейными тест – культурами, в том числе условия их хранения и ведение документации:

Ответственный за правильное хранение музейных тест-культур – сотрудник лаборатории, определённое руководителем организации.

Источник

Методы утилизация музейных штаммов в условиях кафедры

Характеристика кишечной палочки Е.coli, Salmonella Typhimurium и Staphylococcus aureus. Экологически опасные работы в лаборатории. Методы утилизации музейных штаммов. Стерилизация лабораторной работы. Наблюдение за ростом музейных штаммов и результаты.

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru

Тема моей курсовой работы « методы утилизация музейных штаммов в условиях кафедры ». Я работаю с такими штаммами как Е.coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus.

При культивировании микроорганизмов важным этапами является:

— правильный подбор питательной среды;

— приготовление питательной среды;

— правильно произвести посев;

Существуют следующие методы утилизации:

— утилизация химическими реагентами.

Целью данной курсовой работы является:

— закрепление и углубление знаний;

— изучение различных методов утилизации музейных штаммов.

Задачей данной курсовой работы является:

— применение различных методов утилизации музейных штаммов в условиях кафедры;

— показать знания и состояние изученности избранной темы;

— соблюдение правил техники безопасности.

Роль в биотехнологии.

Е. coli используют в развитии вакцин, биологической очистки, в производстве биотоплива, в производстве иммобилизованных ферментов.

За время эксперимента обнаружен широкий спектр генетических изменений. Наиболее поразительной адаптацией стала появившаяся у одной из популяций способность усваивать цитрат натрия.

Непатогенные бактерии E. coli, в норме в больших количествах населяющие кишечник, могут, тем не менее, вызвать развитие патологии при попадании в другие органы или полости человеческого тела. Если бактерия попадает через отверстие в ЖКТ в брюшную полость, может возникнуть перитонит. Попав и размножившись во влагалище женщины, бактерия может вызвать или осложнить кольпит. Попадание бактерии в предстательную железу мужчины может быть патогенезом острого или хронического бактериального простатита. В таких случаях в лечение включается применение антибиотиков, проводимое таким образом, чтобы не подавлять нормальную микрофлору кишечника, иначе возможно развитие дисбактериоза.

E. coli очень чувствительна к таким антибиотикам, как стрептомицин или гентамицин. Однако, E. coli может быстро приобретать лекарственную устойчивость [1].

Стафилококки делятся по пигментообразованию:

— стафилококк лимонно-желтый [2].

Название бактерия получила благодаря своему внешнему виду под микроскопом: в отличие от большинства бактерий, которые бесцветны, Staphylococcus aureus имеет золотистый цвет, обусловленный пигментами из группы каротиноидов.

Salmonella typhimurium палочка Бреслау штамм бактерий, вызывающий у человека пищевые отравления при употреблении термически необработанной пищи [3].

1.4 Методы охраны труда и окружающей среды

Под охраной окружающей среды понимают совокупность международных, государственных и региональных правовых актов, инструкций и стандартов, доводящих общие юридические требования до каждого конкретного загрязнителя и обеспечивающих его заинтересованность в выполнении этих требований, конкретных природоохранных мероприятий по претворению в жизнь этих требований.

Охрана окружающей среды складывается из:

— правовой охраны, формулирующей научные экологические принципы в виде юридических законов, обязательных для исполнения;

— материального стимулирования природоохранной деятельности, стремящегося сделать ее экономически выгодной для предприятий.

Настоящая Концепция экологической безопасности разработана исходя из приоритетов Стратегии «Казахстан-2030» в соответствии со Стратегическим планом развития Республики Казахстан до 2010 года.

Обеспечение оптимального уровня экологической безопасности с достижением нормативных показателей состояния окружающей среды предполагает поэтапную реализацию положений данной Концепции.

В ходе проведения работ была максимально предотвращена возможность попадания лабораторного материала в окружающую среду.

Также для улучшения окружающей среды согласно имеющемуся законодательству РК в лаборатории проводятся следующие мероприятия:

1. Воздух после использования в лабораториях очищается воздушными фильтрами

2. Питательные среды и посевной материал после использования подвергаются автоклавированию, и лишь после этого утилизируются.

3. Лабораторная посуда перед утилизацией обрабатывается формалином или автоклавируется.

4. Зараженная лабораторная одежда сжигается.

Таким образом, для обеспечения здоровья населения и предотвращения заражения окружающей среды лаборатория действует в соответствии с установленными внутренними правилами и инструкциями.

Развитие человеческого общества и совершенствование сельскохозяйственного производства происходит в тесном взаимодействии с природой, так как материальной базой для сельского хозяйства является земля, вода, растительный мир, т.е. природные ресурсы.

Иными словами, охрана труда включает в себя неукоснительное соблюдение требований законодательства по охране труда, технике безопасности и производственной санитарии. Последние включает в себя, систему организационных, технических, гигиенических и санитарно-технических мероприятий, средства предотвращающие воздействия на работающих в опасных и вредных производственных условиях.

Правила по технике безопасности и производственной санитарии.

Все производственные помещения, оборудование, технологические процессы должны отвечать требованиям обеспечения здоровых и безопасных условий труда.

Требования к производственному оборудованию, равно как и к его размещению и организации рабочих мест, а также требования безопасности, предъявляемые к организации производственных процессов и направленные на предупреждение производственного травматизма, закрепляются в правилах по технике безопасности. Перечень допускаемых стандартами (санитарными нормами) уровней концентрации и других параметров, опасных и вредных производственных факторов, свойственных производственным процессам, содержит нормы производственной санитарии, предотвращающие возникновение профессиональных заболеваний работников.

Чтобы требования охраны труда соблюдались работниками, на администрацию возложено проведение инструктажа.

Помимо инструктажа рабочие (в зависимости от сложности профессии) знакомятся с правилами по охране труда применительно к своей профессии. В случае их нарушения или применения неправильных, опасных методов и приемов работы работник проходит внеплановый инструктаж.

Охрана труда включает обязательные предварительные при поступлении на работу и периодические медицинские осмотры и является в своей основе предупредительной мерой для предохранения здоровья сотрудников от воздействия вредных и опасных факторов.

При работе с химическими веществами соблюдают следующие правила предосторожности:

а) сухие реактивы надо брать только чистой фарфоровой ложкой или шпателем;

б) едкие щелочи (КОН, NаОН) берут тигельными щипцами. При измельчении кусков щелочи надевают перчатки и предохранительные очки;

в) химические реактивы подлежат хранению в сосудах с этикетками, на которых указаны названия веществ;

г) работая с кислотами и щелочами, нельзя допускать попадания их на руки, одежду и стол.

Требования по безопасному обращению с электрооборудованием:

* электроаппаратура в лаборатории устанавливается и заземляется специалистами-электриками.

* в помещении, где установлены приборы, должны храниться инструкции по их эксплуатации с кратким описанием каждого прибора.

* на полу перед каждым электроприбором должен лежать резиновый коврик.

* к электроприборам и установкам, находящимся под током, необходим свободный доступ.

* запрещается работать с электроприборами и приближаться к ним в темноте, хранить вблизи них одежду, легковоспламеняющиеся материалы.

Меры пожарной безопасности

Для предупреждения возникновения пожара воспрещается:

* курить в производственных помещениях (для курения необходимо выделить оборудованное место);

* оставлять бумагу и другие легковоспламеняющиеся материалы на шкафах и за шкафами, на радиаторах центрального отопления, вблизи электропроводов и электроприборов;

* оставлять не выключенными электроприборы, плитки и электроосвещения;

* нарушать электропроводку, заставлять шкафами и завешивать плакатами, газетами и.т.д., электропровода и электровыключатели;

* пользоваться неисправными или с открытой спиралью электронагревательными приборами (плитками, электропечами, рефлекторами);

* в лаборатории на видном и доступном месте должны находиться противопожарные средства: огнетушитель, кошма;

* администрация лаборатории обязана регулярно проверять знание сотрудниками правил техники безопасности, и вести запись об этом в специальном журнале, где указаны фамилия, имя, отчество сотрудника, дата проведения ознакомления с правилами техники безопасности и противопожарной безопасности и подпись сотрудника.

Охрана труда направлена на обеспечение условий для выполнения работы человеком без последствий для здоровья, сохранение жизни работников в процессе трудовой деятельности.

Закон РК «Трудовой кодекс» от 15 мая 2007 года, которым определены следующие основные принципы в области охраны труда:

* приоритет жизни и здоровья работника по отношению и результатам производственной деятельности;

* недопущение необратимых процессов вредного воздействия производственных факторов на жизнь и здоровье работника;

* установление единых требований в области охраны труда посредством принятия нормативных правовых актов;

* государственное регулирование вопросов безопасности и охраны труда;

Данный закон обеспечивает гарантии прав работников на безопасность и охрану труда, определяет обязанности работодателей и работников, устанавливает систему правовых взысканий за нарушение законодательства [4].

В лабораторных помещениях всегда поддерживается порядок и чистота. Перед работой и после в ламинар-боксе гибридомной технологии, рабочие поверхности дезинфицируют и, обязательно, включают на 30 минут УФЛ лампы. После работы отработанный материал подвергается автоклавированию.

Примером правильного экологического подхода в решении производственных задач на этом предприятии можно отметить зеленые насаждения вокруг здания лаборатории [5].

1.5 Экологически опасные работы в лаборатории

1.5.1 Стерилизация ультрафиолетовым излучением

Ультрафиолетовые лампы используются для стерилизации (обеззараживания) воды, воздуха и различных поверхностей во всех сферах жизнедеятельности человека. В наиболее распространённых лампах низкого давления почти весь спектр излучения приходится на длину волны 253,7 нм, что хорошо согласуется с пиком кривой бактерицидной эффективности (то есть эффективности поглощения ультрафиолета молекулами ДНК). Этот пик находится в районе длины волны излучения равной 253,7 нм, которое оказывает наибольшее влияние на ДНК, однако природные вещества (например, вода) задерживают проникновение УФ.

Бактерицидное УФ излучение на этих длинах волн вызывает димеризацию тимина в молекулах ДНК. Накопление таких изменений в ДНК микроорганизмов приводит к замедлению темпов их размножения и вымиранию. Ультрафиолетовые лампы с бактерицидным эффектом в основном используются в таких устройствах, как бактерицидные облучатели и бактерицидные рециркуляторы.

Ультрафиолетовая обработка воды, воздуха и поверхности не обладает пролонгированным эффектом. Достоинство данной особенности заключается в том, что исключается вредное воздействие на человека и животных. В случае обработки сточных вод УФ флора водоемов не страдает от сбросов, как, например, при сбросе вод, обработанных хлором, продолжающим уничтожать жизнь ещё долго после использования на очистных сооружениях.

1.5.2 Воздействие на здоровье человека

Воздействие ультрафиолетового излучения на кожу, превышающее естественную защитную способность кожи к загару, приводит к ожогам.

Ультрафиолетовое излучение может приводить к образованию мутаций (ультрафиолетовый мутагенез). Образование мутаций, в свою очередь, может вызывать рак кожи, меланомукожи и преждевременное старение.

1.6 Методы утилизации музейных штаммов

Существуют следующие методы утилизации бактерии:

— утилизация химическими реагентами (белизна, диохлор) ;

Утилизацию автоклавированием проводят следующим образом, использованные штаммы погружают в автоклав на 1,5 часа при 1 атмосфере. Утилизация автоклавированием является наиболее практичным и часто используемым методом.

Утилизацию химическими реагентами (белизна, диохлор) проводят следующим образом, 100 мл белизны разводят в 1 л дистиллированной воде. Затем питательные среды с посевами бактерии заливают белизной на 45-60 минут, после этого белизну выливают, а питательные среды с посевами бактерии выкидывают в целлофановый пакет. Утилизацию диохлором проводят следующим образом, питательные среды с посевами бактерии заливают раствором диохлора на 45-60 минут. После 45-60 минут раствор диохлора выливают, а питательные среды выкидывают в целлофановый пакет.

В данной курсовой работе, в дальнейшем музейные штаммы будут утилизировать белизной.

1.7 Экономическая эффективность

Экономическая эффективность показывает конечный полезный эффект от применения средств, производства и живого труда, отдачу совокупных вложений.

Основные задачи экономической эффективности:

— достижение максимального эффекта при заданном уровне затрат

— достижение заданного эффекта при минимальных затратах.

Источник

Музейные штаммы микроорганизмов что это

На правах рукописи

ПУЗАНОВ Владимир Алексеевич

МУЗЕЙНЫЕ ШТАММЫ РОДА MYCOBACTERIUM. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ПОДДЕРЖАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте туберкулеза Российской Академии Медицинских наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Голышевская В.И.

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Леви Д.Т.

доктор биологических наук, профессор Баснакьян И.А.

1998 г. в часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

1 l’wi д ttt ттттппгтттттпт

rti\j JMJionuulb игurwjcivia.

Известно. что биологические материалы в процессе хранения и пересевов изменяют или утрачивают некоторые свои свойства несмотря на высокую устойчивость к химическим и физическим воздействиям. Род Mycobacterium не является исключением из этого ряда. Изучение биологических и биохимических характеристик основных музейных («коллекционных) лабораторных и клинических штаммов имеет важное практическое, научное и теоретическое значение. Проблема стандартизации типичных музейных штаммов остается значимой в современной микробиологии, что связано с необходимостью сравнения различных лабораторных исследований независимо от места и времени их проведения. Очевидно, что чем более тонко и полно охарактеризован музейный штамм, тем больше возможностей представляется исследователю для обнаружения изменений, наступающих непосредственно со штаммом и сравнения результатов экспериментов с контрольными или ранее полученными. Подробное описание штаммов микобактерий позволяет усовершенствовать документацию (паспорта), сопровохдэощую штаммы.

Изучить основные биологические и биохимические свойства лабораторных штаммов рода Mycobacterium из музея культур ЦНШТ РАМН, а также клинических чувствительных и резистентных изоля-тов от больных туберкулезом.

1.Изучить тинкториальные и культуральные особенности МБ.

£.Изучить выживаемость и сохранение осноеных биологических свойств MB при хранении в различных температурных условиях.

3.Охарактеризовать биологические свойства М.tuberculosis Academia с целью замены тест-штамма М.tuberculosis H37Rv.

4.Разработать метод клонирования МБ.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1.Метод клонирования Ж.

Z.Тест-штамм М.tuberculosis Academia.

3.Дополнительные методы окраски для характеристики тинкто-риальных сеойств лабораторных штаммов.

4.Дополнительные характеристики для паспортизации лабораторных и клинических культур.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ.

При изучении тинкториальных особенностей 5 основных музейных штаммов рода Mycobacterium в фазе экспоненциального роста и при хранении до б мес. с оспользованием стандартных (Циль-Нильсена, Бой) и нетрадиционных (Грам, Романовского-Гимза) методов окраски определено, что морфологические и тинкториальные свойства типичных (палочковидных),кокковидных и L-форм МБ, а также их наличие и количество меняются б зависимости от вида, Еозрас-та культур или срокоЕ их хранения.Предложено использовать указанные методы окраски для оценки свойств МБ.

Изучены в сравнении культуральные особенности ряда музейных и клинических чувствительных и резистентных к противотуберкулезным препаратам штаммов МБ, позволяющие в деле контроля правильности приготовления питательных сред и определения лекарственной резистентности МБ, заменить вирулентный штамм М.tuberculosis H37Rv на авирулентный штамм М.tuberculosis Academia.

На основе концепции о S- и R-формах микобактерий разработан биологический метод клонирования фенотипически полноценных культур МБ. Предложен метод определения степени вирулентности микобактерий по массивности обсемененности паренхиматозных органов экспериментальных животных.

Установлена различная антибактериальная активность препаратов в отношении штаммов МБ, применяемых для оценки МИК.

Основные положения диссертации доложены на Всесоюзном семинаре «Современные проблемы антибиотикорезистентности»(‘1988); Симпозиуме ЦНИИТ по вопросам изменчивости микобактерий туберкулеза (1988); Всесоюзном семинаре»Микробиологические методы исследования во фтизиопульмонологии» (1990); Всероссийской научно-практической конференции «Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики инфекций»(1993); Выездном цикле усовершенствования врачей-лаборантов в Гомеле,Беларусь (1996); 5 и 6 национальных конгрессах по болезням органов дыхания (1995, 1996); 7 съезде ВОЗШ (1997); Научно-практических конференциях ЦНИИТ (1990); Секции «Микробиология и иммунология туберкулеза»

Московского отделения ВОЭМП и Курсах усовершенствования фтизиатров и микобактериологов в ДНИИТ; в ЦНШТ на совместном заседании отделов микробиологии, патоморфологии и иммунологии (1996).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Работа изложена на страницах машинописного текста, включая иллюстрации 19 таблиц и 6 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, 6 глав собственных исследований, заключения и выеодов, указателя литературы, включающего 117работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Микробиологические анализы были выполнены согласно приказа Минздрава СССР N 558 «Об унификации микробиологических методов «следования при туберкулезе»(1978).

Для дифференциации М.tuberculosis и М.bovis использовали комбинированную среду с ТСХ и НаМОз на основе плотных сред Ле-венштейна-Йенсена (ЛЙ) и Попеску (П) [Приказ N558,1978;11опеску Т.Т.,1990;Гришина Т.Д.,19943.Для дифференциации атипичных мико-бактерий (АМБ) использовали методы, рекомендованные приказом МЗ СССР N 558, кроме того применяли ряд сред и методик американской схемы определений микобактерий (МБ)[Mycobacterium culture collection,19801.При типировании атипичных микобактерий и клас-

снфикации их по группам (Ranvon) использовали методы описанные в Приказе N558, дополнительно изучали рост на средах с ТСХ, резистентность к гидрокоиламину.

Лекарственную устойчивость (ЛУ) клинических изолятов и музейных штаммов МБ определяли методом абсолютных концентраций (моноустойчивость).Ряд по определению ЛУ включал две контрольные пробирки без ПТП, пробирку с комбинированной средой, содержащей ТСХ (0,1 мкг/мл) и 0,1% NaNOs, среды с ПТП и салициловым натрием.

Морские свинки и мыши были получены из центрального питомника экспериментальных животных РАМН (Столбовая,Мое.обл.) и содержались в виварии ЦНИИТ РАМН.Зутаназию животных проводили под эфирным (этиловый эфир), гексаналовым или тиопенталовым наркозом посредством введения в/бршинно ( 150-200 мг/кг массы).

Статистическую обработку результатов исследований производили в соответствии с рекомендациями И.П.Ашмарина и А.А.Воробьева «Статистические методы в микробиологических исследованиях».

ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ МИКОБАКТЕРИЙ.

Результаты бактериоскопии на примере М.tuberculosis Erdman представлены в таблице 1.

Тинкториальные свойства М.tuberculosis Erdrnan.

Метод окраски i Возраст культуры j Сроки хранения культуры i

1 3 нед. | 1,5 мес. i ¡ 5,5 мес.

По Бою 1 Изогнутые палочки,|То же, что в 1 1 МВТ зернистые

изолированно лека-¡3-х недельной |по всей длине,

щие и в скоплениях)культуре. 1 часть их блед-

До 20% МВТ не окра| |но окрашена.

По Цилю- | Тонкие, изогнутые В МБТ выражена

Нильсену | палочки размером зернистость,

! 1,5 до £ мкм. Еди часть МБТ сла-

| ничные шаровидные боокрашена,еди

| структуры диамет- ничные слабоок

I ром 2-10 мкм. решенные зерна

По Граму I Фиолетовые Г(+)- Много Г(+)-зе-

I зерна и палочки. рен.

По Романов- 1 МБТ не окрашены, Часть МБТ окра Скопления си-

скому-Гимае | скопления сесто- шена в сирене- реневых и фио

| преломляющих вый или фиоле- летовых МБТ.

! структур. товый цвет,еди

молодые вирулентные культуры Erdman и Bovinus-8 не окрашиваются гематологическими красителями, но по мере старения часть клеток приобретает сиреневую или фиолетовую окраску. Культуры с ослабленной вирулентностью, независимо от возраста, хорошо окрашиваются этими красителями.

Тинкториальные свойства МБ являются значимым дифференциально-диагностическим тестом, позволяющим характеризовать микобактериальную популяцию по элементам ее составляющим.Использование четырех методов окраски является обязательны),i этапом для видоеой характеристики штамма, и может быть рекомендовано как один из экспресс-тестов с включением в Паспорта музейных культур.

РОСТОВЫЕ СВОЙСТВА И ВЫЖИВАЕМОСТЬ МИКОЕАКТЕРИЙ ПРИ ХРАНЕНИИ В РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЯХ.

С целью изучения ростовых сеойств МБ на основе радиоизотопного метода определена метаболическая активность МБ и возможность ускоренной идентификации штаммов.

Скорость деления МБ на жидких питательных средах

Штамм Ж i i ¡Питательные среды| i i i i igs т+1д5(час

1 1 i N 3 | • i 35 66 26,3+4,3

iJAM i i |Школьникова+10%пл| * * 7,4+0,4

1 1 | Локкеман | t t 105 282 16,9+1,2

M.bovis Bovinus-ö 1 1 |Школьникова+10%пл| 1 1 ** ** 8,3+1,7

1 1 | N 3 | 12,6 26 23,0+4,2

i 1 |Школьникова+10%пл| л 12,4+0,6

1 N 3 | i i 13,4j 19,2|32,7+5,4 i i

Было проверено также влияние величины инокулята на скорость деления МБ в жидкой питательной среде N3. Результаты опытов приведены в таблице 3.

Злияние величины инокулята на скорость деления клеток МБ (часы).

Величина инокулята Скорость деления МБ при посевной дозе.. в часа;-; в 1мл(Х+I95)

Штамм МБ i 2,5х104 1 i 2,5х10б 2,5х107

М. tub.H37Rv I 25,4+4,0 ¡ 26,6+4,1 26,3+4,3

1 I конгл. 1 i i конгл.

После приготовления | 235 1 i 1 192 1 87

взвеси по 5 ст.мут. | 1 1 i i

1 После 2 дней инку- | 338 I I 1 262 1 19

бации на среде Дюбо | i 1 1 i i

Аналогичные результаты были получены и на жидкой питательной среде Ш, с включением в ее состав Твин-80. Определено,что сочетанная дезинтеграции взвеси МВТ механическим способом (растиранием) совместно с использованием детергента является недостаточной. Данный метод не допускает возможности копийного повторения опыта.

Была предпринята попытка получения однородного гомогената MB используя ультразвуковой дезинтегратор (УЗД). Испытанию были подвергнуты штаммы М.tuberculosis H37Rv и М.bovis BCG.Взвесь МБ подвергали воздействию УЗД (Bransonic,США).длительность воздействия от 1,3,6,10 мин.- до 20 мин. Результаты сравнивали с контрольной пробой со взвесью МБ, не подвергавшихся обработке.

Для выявления характера изменений наступивших в популяции МБ после волнового воздействия использовали методы бактериоскопии по Б и Мурохаши (М) для определения живых и мертвых клеток МБ.

Исходя из постулата, морских свинок заражали внутрисердеч-но взгесыо нескольких штаммов МБ в дозе 1х109 микробных клеток по оптическому стандарту мутности. Через 7 дней проводили зута-назню животных, делали мазки-отпечатки из паренхиматозных органов (легких, печени и селезенки), а биоптат растирали в ступке. Гомстенат разводили до 10

7 и из каждого десятикратного разведения по 0,1мл высевали на чашки Петри со средой Финна-2.

Обработку патологического материала детергентами не проводили, т.к. предварительно было показано, что после обработки клинических полирезистентных штаммов соответствующими р-рами кислоты, NaOH или ХГГ высеваемость их на питательной среде была ниже, чем в контроле.

В мазках-отпечатках органов окрашенных по Бою, подсчитывали количество отдельно лежащих клеток МБ. Через 14-21 дней инкубации на средах подсчитывали отдельные колонии МБ. Единичные

колонки из предельных разЕедений снимали петлей и переносили на косяки с аналогичной средой, получая таким образом посевной материал для накопления клонированной биомассы.

Бактериоскопическое наблюдение за количеством МБ в мазках-отпечатках органов и определение КОЕ показало высокую степень корреляции между изучаемыми признаками и его достоверность (г min = 0,95). Анализ ДНК, выделенной из клонированных штаммов, с помощью метода дактилоскопии показал, что испытуемые клоны генетически однородны. Совместно с сотрудниками лаборатории биотехнологии и клинической иммуногенетики ЦНИИТ РАМН к.б.н. Черноусовой Л.Н. и к.б.н.Калининой O.A. на основании данных иммуноблотинга микобактериапьных культур с моноклональ-ными антителами, специфичными к М. tuberculosis-комплексу, показали, что у МБ, высеянных из организма человека, в сравнении с аналогами, полученными с искусственных питательных сред, определяются как общие, так и уникальные антигенные детерминанты, т.е.имеются различия в антигенной структуре. Различия в антигенной структуре были показаны и при тестировании музейных штаммов МБ: М.tuberculosis H37Rv, Academia и Erdman; M.bovis Bovinus-8 и BCG. Методом Western blot с моноклональными антителами к M.tuberculosis-комплексу были выявлены сходства и различия в антигенной структуре как МБ, относящихся к М.tuberculosis по сравнению с М.bovis, так и МБ, относящихся к разным штаммам одного вида.

Разработанные совместно с к.м.н.Корнеевым А.А.и к.ы.н.Гришиной Т.Д. методы определения вирулентности и клонирования штаммов МБ представляются принципиально важными для создания выверенных коллекций фенотипически однородных культур МБ. Модель клонирования может иметь применение и в молекулярно-гене-тических исследованиях.

i.Использование методов бактериоскопии по Циль-Нильсену, Зою.Граму и Романовскому-Гимзе позволило изучить клеточный состав микобактериальной популяции в экспоненциальной фазе роста и при хранении. Определено, что морфологические и тинкториальные свойства микобактерий меняются в зависимости от вида, возраста культур и их вирулентности.

2.Определено,что ростовые свойства лабораторных штйммое целесообразно изучать на жидких питательных средах с добавлением 101 плазмы крови.Величина инокулята микобактерий в посевных дозах от 104 до 1С’ не влияет на скорость деления клеток микобактерий. Установлено, что наиболее полно биологические свойства МБ сохраняются в рабочих культурах штаммов микобактерий, содержащих в своем составе бычий сывороточный альбумин и твин-80 при температуре-70°С.

5.Теоретической основой для разработки метода клонирования послужила концепция утверждающая, что микобактерии в организме человека и чувствительных животных находится в S-форме и являются фенотипически полноценными, не подвергаются конгломерации.

Разработанный биологический метод клонирования позволяет получать клоны из единичных клеток при посеве мокроты от больных туберкулезом или органов экспериментальных тавотных.Метод позволяет создавать выверенные коллекции лабораторных штаммов ми-кобактерий с заданными характеристиками.Модель клонирования может найти применение в молекулярно-генетических исследованиях.

1.Для получения клонированных штаммов использовать феноти-пически полноценные культуры (изоляты) от больных или из паренхиматозных органов чувствительных животных (морских свинок);

2.Дли оценки тинкториальных свойств лабораторных и экспериментальных штаммов микобактерий использовать комплекс красителей предусмотренных методами Циль-Нильсена, Боя, Грама и Ро-манавского-Гимза;

3.В качестве биологически безопасного и чувствительного к основным противотуберкулезным препаратам, предложено использовать референс-штамм М.tuberculosis Academia для контроля постановки методов определения лекарственной резистентности клинических штаммов микобактерий, а также для изучения ростовых свойств микобактерий и их выживаемости при различных условиях и специальных воздействиях на микобактерии;

4.С целью сохранения биологических сьойств основных музейных штаммов предложено периодическое пассирование их через организм чувствительных животных;

5.Предложено дополнить паспортные характеристики коллекционных штаммов микобактерий результатами окраски по Граму и Ро-мановскому-Гимзе, нитратредуктазной активности роста на комбинированной среде с ТСХ и NaNOy, роста на среде с салициловокис-лым натрием. В ряд по определению лекарственной устойчивости включить комбинированную среду и среду с салициловокислым натрием.

Источник